6． 加入2μl无RNA酶的DNA酶I（10U／μ1），37 ℃孵育15 min降解模板DNA。
7． 加入0.2M EDTA（pH 8.0）溶液2μl终止反应。
8． 加入2.5μl的4 M Licl和7.5μl冷的无水乙醇，混匀，-20 ℃放置2h。
9． 12000g下离以 15 min，弃上清，小心地用50 μl冷的70％乙醇洗涤沉淀。
1O．室温下稍干燥，溶于100μ1 DEPC处理过的三蒸水中，混匀分装，-20 ℃下
1． 将子宫样品从-80 ℃取出，用OCT包埋，在-23 ℃（切片机腔体温度）平衡
至少30 min。将包埋好的样品固定在样品头上，切10μm厚的连续组织
切片，平铺于涂有多聚赖氨酸（1mg／m1）的玻片上（玻片预先经180 ℃干
2． 冰冻切片经室温干燥10 min后，在4％的多聚甲醛-PBS（pH 7.4）固定lO
3． 活跃的DEPC-PBS（未高压的0.1％DEPC-1XPBS溶液）洗2次，每次5 min。
4． 在0.2M的盐酸作用中作用10 min后，重复步骤4）。
5． 在切片上滴加蛋白酶K（0.1μg／m1），37 ℃孵育15 min，重复步骤4）。
6． 经0.1M TEA（三乙醇胺）作用5min后，再在新配制的0.25％AA／0.1M TEA
（乙酸酐／三乙醇胺，pH 8.0）中乙酰化10 min。
8． 在脱水后的玻片上滴加预杂交液（约100 μl／玻片），置于放有湿盒液（50％
甲酰胺v／v；0.3 M NaCl；1Mm EDTA；10 mM Tris-Cl，pH 8.O）的湿盒中，
9． 甩掉预杂交液，地高辛标记的反义或正义cRNA探针（浓度1-2ng／μl）经
70 ℃变性1O分钟，置冰上1 min，玻片上滴加预杂交液（约60μl／玻片），
覆盖parafilm膜，放湿盒中在48～58 ℃下杂交18-30 h。
1O．取出玻片，小心去掉Parafilm膜，甩掉杂交液，用52 ℃预热的5×SSC洗
30 min。
11．在无DNA的RNA酶A（20μg／ml）溶液中37 ℃下孵育30 min。
12．分别依次用52 ℃预热的2 X SSC，1 X SSC和O.1 X SSC洗2次，每次30 min。
13．在缓冲液A（0.1M Tris-HC 1 pH 7.5，0.15M NaC1）中平衡5min。
14．在玻片上滴加碱性磷酸酶的抗地高辛抗体（1：500～1:2000稀释于含0.5％
16．在缓冲液B（0.1M Tris-HCl；0.1M NaCl；0.05M MgCl_2，pH 9.5）中平衡5
17．硝基四氮唑蓝（NBT）和5-溴-4-氯-3-吲哚氧磷酸盐（BCIP）溶于缓冲液B
中，每ml缓冲液B含有4.5μ1 NBT和3.5μ1 BCIP。在玻片上滴加混合染
18．充分显色后，用EDTA（1 mM EDTA，pH 8.0）洗15 min终止反应。
20．用蒸馏水洗15 min除去可能存在的结晶体。
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