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sybrgreen链式反应的能力7700

发布日期：2012/9/14 9:04:24 阅读次数：1754次

Materials
ROX Passive Reference Dye 25 µM, 50x （Invitrogen, Cat. No. 12223-012）
SYBR Green I, "10,000x" concentrate （Molecular Probes, Cat. No. S7563）
SureStart Taq polymerase 5 U/µL （Stratagene, Cat. No. 600280）

Solutions
SYBR Green 1:100 dilution （50 µL SYBR Green concentrate, 5 mL DMSO, store aliquots at -20ºC in dark tubes in a dessicator）

SYBR Green 1:2000 solution （0.5 mL of SYBR Green 1:100 dil., 1 mL glycerol, 10 uL Tween, 8.5 mL H2O, store at -20ºC in dark tubes）

KG-1 （10x）		KG-2 （10x）
Amount	[final]	Amount	[final]
8.3 mL 1M （NH4）2SO4	166mM	50 µL of 100mM dNTP Stocks （x4）	（@10 mM）
33.5 mL Tris pH 8.8	670 mM	50 µL DMSO	10%
174 µL B-ME	50 mM	50 µL BSA （8 mg/mL stock）	0.8 mg/mL
3.35 mL 1M MgCl2	67 mM	200 µL H2O
q.s. to 50 mL with H2O

PCR Reaction Setup
1. Create a ｍaster mix by multiplying this recipe by the number of reactions （add 10% for pipeting error）:

2 µL Primer-1
2 µL Primer-2
2 µL KG-1
2 µL KG-2
5 µL 1:2000 SYBR Green solution
0.4 µL ROX Dye 25 µM
0.1 µL SureStart Taq
6.5 µL H2O

2. Setup individual reactions in PCR tubes or plates with optical caps or optical tape:

20 µL Master Mix
1 µL DNA （~ 50 ng genomic DNA）

Machine Setup
1. If the machine status reads "Idle" but a user still has not remove their samples then "Save" the current file to preserve the users data before shutting down.
2. Shut down both the machine ａnd the computer. Turn on the detector first then boot the computer.
3. Launch SDS v1.9 software （don＇t use v1.7）.
4. Create a new template:
    Dye Layer = SybrGreen
    Sample Type = Sample type setup.   Choose SYBRG for UNKN, NTC. Deｓelect quencher.
    Select wells with samples. Set sample type to UNKN （or NTC）.
5. Program thermocycle conditions
    95ºC 5＇ Hold （Stage I）
    95ºC 15", 60ºC 30", 72ºC 30" （x40）（Stage II - this stage is emperic）
    60ºC 15" Hold （Stage III）
    95ºC 15" Hold （Stage IV）

Select Stage IV ａnd set ramp time to maximum （19:59）.

Select "Show Data Collection..."

Select ａnd ｄelete the documents for stage III ａnd IV.

Select to add documentation of the Stage IV ramp.

6. Select "Show Analsis..." > Instrument > Diagnostics > Advanced Options

Select: Set 7700 exposure time for plates 25 （caps）, or 10 （film）.
Reference = Rox （unless no reference is used）

7. Save the template to the "Fero Lab" folder.
8. Place plate in sample block, close lid ａnd shut door. Select "RUN".

Saving ａnd processing data
9. When the machine has finished cycling the status will read, "Idle". Save the file again before quitting.
10. To save dissociation curves: ｓelect File > Export... > Multicomponent...

材料

火箭被动参考染料25µ男，50倍（公司，猫。第12223-012）

荧光绿色我，“10000×”集中（分子探针，猫。第s7563）

“确保开端”耐热聚合酶5 /µ我（盒，猫。600280号）

解决方案

绿色荧光: 100稀释（50µ我绿色荧光，5毫升的二甲基亚砜，存储在- 20摄氏º等分暗管在一个灯）

绿色荧光2000溶液（0.5毫升的绿色荧光，1毫升1 : 100迪勒。甘油，10的吐温，8.5毫升水，储存在- 20摄氏º暗管）

kg - 1（10）

公斤- 2（10）

量[*后]

8.3毫升（NH 4）2SO 4 166mm 100万

50µ我100核苷酸股票（X）（10毫米）

33.5毫升的三值8.8 670毫米

50甲基亚砜10%µ我

174µ我B -我50毫米

50µ我牛血清白蛋白（8毫克/毫升股票）0.8毫克/毫升

3.35毫升1氯化镁67毫米

200µ我水

适量至50毫升的水

聚合酶链反应的反应装置

1。创建一个混合大师乘以这个食谱的一些反应（加10%为吸量误差）：

2µ我primer-1

2µ我primer-2

2µ1公斤

2µ1公斤- 2

5µ我2000绿色荧光的解决方案

0.4µ我火箭染料25µ米

0.1µ我“确保开端”标签

6.5µ我水

2。设置个别反应在反应管或板与光学或光学磁带：

20µ我混合大师

1µ我脱氧核糖核酸（~ 50毫微克基因组脱氧核糖核酸）

机器安装

1。如果机器状态“闲置”但用户仍然没有消除他们的样品，然后保存当前文件保存用户数据之前关闭。

2。关闭两个机器和电脑。打开检测器先启动计算机。

3。发射系统工具软件（不使用工具）。

4。创建一个新的模板：

染料层= sybrgreen

样品类型=样品类型设置。选择sybrg为未知数，热敏电阻。取消淬火。

威尔斯选择样本。集样本类型未知（或电阻）。

5。程序thermocycle条件

95º5 ＇举行（阶段）

95º15”，60º30“，30”，72º（产品）（第二阶段——这个阶段是emperic）

60º15”（第三阶段）

95º15”（第四阶段）

选择第四阶段，斜坡时间*长（19:59）。

选择“显示数据的收集……”

选择并删除文件的阶段第三和第四。

选择添加文件的第四阶段的坡道。

6。选择“显示分析……”>工具>选项>高级诊断

选择：7700曝光时间25（帽），或10（电影）。

参考=火箭（除非没有参考用）

7。保存模板的“附近的实验室”的文件夹。

8。地方板样块，关闭盖子和关闭门。选择“运行”。

保存和处理数据

9。当机器已完成循环状态会读，“闲置”。保存文件之前。

10。拯救解离曲线：选择文件>导出…“多元…

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