聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种广泛使用的技术从生物样品中蛋白质的分离。此外，发展二维（平面）凝胶电泳提供了一个工具，差异蛋白显示，它允许的定量分析的许多（~ 500 - 1000）蛋白质同时。复杂的生物问题，现在可以探讨分析不同模式的二维凝胶之间的控制和实验状态。

而高灵敏度的染色方法，可以可视化蛋白质在越来越低的水平，原来的蛋白质鉴定是有限的敏感性，埃德曼测序。然而，在过去几年中质谱已成为建立一个可行的和更为敏感，具有发展质谱和飞行时间质谱。肽质量指纹使用肽群众得到消化的蛋白质和核酸数据库搜索，以找到蛋白质表明了类似的理论消化模式（见例如，舍甫琴科等人。1996年2）。

在该协议下，我们描述胶消化程序，因为它是例行的在我们的实验室，肽质量测绘picomole到subpicomole数量的蛋白质来源于考马斯或银染聚丙烯酰胺凝胶。，是从凝胶消化之前，在一些ammoniumcarbonate /乙腈洗涤步骤。切除的凝胶块，随后干燥和水化酶在缓冲区。另外，洗后的凝胶块，可减少和s-alkylated前补液与酶。经过消化，肽提取的凝胶和质量分析。

胶消化程序

材料

25毫米碳酸氢铵50%乙腈

25毫米碳酸氢铵，PH值8

5% / 50%三氟乙腈

0.1毫克/毫升胰蛋白酶（序列，随机）在25毫米碳酸氢铵，PH值8

10毫米二硫苏糖醇在25毫米碳酸氢铵

55毫米25毫米碳酸氢铵碘

一般来说，胰蛋白酶蛋白酶选择肽质量指纹图谱，由于其可靠性和其底物特异性，高产多肽末端基本残留（精氨酸和赖氨酸），这有利于电离和随后的质谱测序。

溶解胰蛋白酶使用前在冰冷的缓冲区（减少auto-proteolysis）。

1。附加蛋白带/景点从凝胶和凝胶块割成小颗粒（~ 1毫米×1毫米）使用手术刀，放入0.65毫升的硅管（临管会科学）。还削减了凝胶一块从蛋白质的地区的凝胶，一个并行控制消化胰蛋白酶自溶的产品识别。

一个小凝胶颗粒尺寸有利于消除十二烷基硫酸钠（和考马斯）在洗，并提高酶进入凝胶。

一个银染协议兼容质谱，看到舍甫琴科等人。（1996年）。

2。添加~ 100毫升25毫米碳酸氢铵50%乙腈（或足够浸入凝胶颗粒）和涡10分钟。用凝胶载入中管提示删除解决方案（淡蓝色如考马斯染色）和报废。重复此洗涤/脱水加紧~ 2 - 3倍。

在这一点上，凝胶片收缩，变成白色的。这种视觉标准应当用于确定是否或不应进行更多的洗涤。

3。干凝胶颗粒~ 15分钟在一个真空离心机。

4。可选的减少和烷基化。添加10毫米二硫苏糖醇在25毫米碳酸氢铵，足以涵盖的凝胶块，并减少为1小时在56℃。冷却至室温并更换溶液的大致相同，卷55毫米25毫米碳酸氢铵碘。孵化为45分钟室温黑暗中偶尔涡流。洗胶件~ 100毫升25毫米碳酸氢铵为10分钟，而涡流，脱水~ 100毫升25毫米碳酸氢铵50%乙腈和水合再次与~ 100毫升25毫米碳酸氢铵脱水了。拆下液相、干凝胶在真空离心机。

5。水合凝胶颗粒在25毫米碳酸氢铵，PH值8，含有0.05 - 0.1毫克/毫升胰蛋白酶的涡旋式为5分钟。不要添加更多的解决方案的数量比可以通过吸收凝胶颗粒，否则会出现很多胰蛋白酶自溶。

该enzyme-to-substrate比采用胶消化大于（> 1 : 10）比在解决消化由于阻碍酶进入蛋白基质中的凝胶。此外，相对低盐浓度为25毫米是用来减少的可能性随后盐干扰与电离质谱仪。这会增加，如果浓度波罗斯微尖或ziptips随后用于脱盐。

6。如果有必要，覆盖水化凝胶颗粒与金额的25毫米碳酸氢铵，PH值8，让他们沉浸在消化。

7。12 - 16小时孵化在37度。

8。恢复肽的凝胶颗粒，执行~ 3。对于个提取，一