小小实验隐藏着大大学问，还记得那些年被您忽视的酶切体系实验要素吗？今天上海劲马小编就带您普及一下关于酶切体系实验要素有哪些吧！首先建立一个标准的酶切体系需要注意的十三个要素，例如怎么去选择正确的酶，DNA甲基化问题，缓冲液，反应体积，反应时间和温度，终止反应，对照反应，稳定性，贮存条件等等。下面小编为您进行详解：

建立一个标准的酶切反应：
   目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间;如果减少酶的用量，对许多 酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。

选择正确的酶：
   不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目 多的酶更频繁地切割底物。假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将 平均在每46（4096）碱基切割一次。内切酶的产物可以是粘端的（3＇＇或5＇＇突出端），也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。

酶：
   内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是*后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而定。例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。

DNA：
   待切割的DNA应当已去除酚、、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。

缓冲液：
   对于每一种酶NEB都提供相应的*佳缓冲液，可保证几乎100%的酶活性。使用时的缓冲液浓度应为1X。有的酶要求100μg/ml的BSA以实现*佳活 性。在这种情况下，我们也相应提供100X的BSA（10mg/ml）。不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响。

反应体积：
   内切酶活力单位的定义是：1小时内，50μl反应体积中，降解1μg的底物DNA所需的酶为一个活力单位。因此酶：DNA的反应比例可以由此确定。较小的反 应体积更容易受到移液器误差的影响。为了将甘油的浓度控制在5%以下，要注意酶的体积不要超过总体积的10%（一般酶都贮存于50%的甘油中）。

混合：
   这是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反应完全，必须使反应液充分混合。我们推荐用枪反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心一下即可。注意：不可振荡!

反应温度：
   大部分酶的反应温度为37°C；从嗜热菌中分离出来的内切酶则要求更高的温度。一般为50-65°C不等。

反应时间：
   1酶活单位的定义时间为1小时。如果加入的酶较多，可以相应地缩短反应时间;反之，如果加入的酶量较少，也可以延长时间以使反应达到完全。

终止反应：
   v 如果不进行下一步酶切反应，可用终止液来终止反应。在NEB我们使用如下反应终止液：50%的甘油，50mM EDTA（pH8.0），和0.05%溴酚蓝（10μl/50μl反应液）。如果要进行下一步酶切反应，可用热失活法终止反应（65°C或85°C，20 分钟）。热失活并不能适用于所有的酶，此外，酚/抽提也可以用于终止反应。

贮存：
   大部分酶应贮存于-20°C。少部分酶则须在-70°C长期保存。详情请参见相关酶的DATA SHEET 或目录相关部分。10X BUFFER 和100X BSA于-20°C保存。BSA不能与NEBuffer混合后保存，否则将会出现BSA沉淀。

稳定性：
   每隔1-2个月都会对所有的酶有一个活性检测；*近的一次检测结果将被贴在售出的每一管酶上。通过十多年来的经验，我们发现大部分酶在推荐的保存缓冲液里在-20°C条件下十分稳定。高于-20°C条件下稳定性将有所降低。

对照反应：
   如果发现您的DNA底物不能被成功切开，可以进行对照实验以查明原因。具体方法如下：
   将不加内切酶的底物DNA（待切底物）与加入了内切酶的对照DNA（有多个已知酶切位点）同时进行反应。若实验结果表明底物DNA降解，则说明DNA在纯化 过程中或反应液里引入了核酸酶污染；若实验结果发现底物DNA保持完整，而对照DNA被成功切开，则可以排除酶质量的原因，此时可以将对照DNA和待切底 物DNA混合起来再次进行反应，以确定样品中是否有抑制剂。如果有抑制剂存在（通常是盐、EDTA或酚），则混合物里的对照DNA也无法被切开。

   看完以上内容您是否领悟到酶切实验在核酸实验中占据重要的位置，而酶切体系的建立对于整个酶切实验的重要性不容忽视。今天的elisa试剂盒相关资讯就分享到这里，想要了解更多实验方面问题，欢迎锁定上海劲马公司哦！

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