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免疫沉淀／蛋白免疫印迹方法解析

发布日期：2015/9/7 14:46:25 阅读次数：3447次

免疫沉淀／蛋白免疫印迹方法解析
免疫沉淀／蛋白免疫印迹方法是实验室常见方法，上海劲马本章将具体为您分析关于免疫印迹法的操作步骤，请按照步骤操作，有任何疑问尽可来电咨询。感谢您的阅读。
• 全细胞裂解液准备请参考实验流程 1.《免疫印迹》中所述方法。
• 预清洗全细胞裂解液（可选）步骤如下：大约 1 ml 全细胞裂解液或组织提取物（参阅：全细胞裂解液或组织提取物表）加入 0.25µg 相应的对照IgG(与一抗的宿主种属相匹配; 参考对照IgGs ａnd IgG标记)，然后与 20µl 适当的悬浮琼脂糖偶联蛋白（蛋白A-琼脂糖，蛋白G-琼脂糖，蛋白A/G-琼脂糖，或蛋白L-琼脂糖)混合，4℃孵育30分钟。
• 4° C 下离心，3,000 rpm（大约1,000xg）30 秒使球珠沉淀。将上清（细胞裂解液）移至一个新的微离心管，置于4° C。
• 每 1 ml 上述经预处理的细胞裂解液或大约 100–1000 µg 总细胞裂解蛋白，加入 10 µg 琼脂糖偶联一抗（相当于 5 µl 球珠），置于摇床并在 4° C 下孵育 1 小时或过夜。
• 如果没有琼脂糖偶联的一抗，可用如下方法：1ml的细胞裂解液与1–10 µl (也就是, 0.2–2 µg) 一抗（一抗浓度需要滴定来决定）在4° C 孵育1-2小时。加入20µl匹配的琼脂糖偶联悬浮液（蛋白A-琼脂糖，蛋白G－琼脂糖，蛋白A/G－琼脂糖或蛋白L－琼脂糖）。加盖并置于摇床 4° C 下孵育 1 小时到过夜。
• 4° C 下，3,000（相当于 1,000xg）离心 30 分钟后收集沉淀物。小心吸去上清，保留沉淀。
• 用 RIPA 缓冲液（sc-24948）（较强烈）或 PBS（缓冲液和常规溶液）（稍缓和）洗涤沉淀 2–4 次。每次重复离心步骤。
• *后一次漂洗后，吸去上清。用 40 µl 2x 电泳上样缓冲液（sc-24945）重悬浮沉淀物。
• 煮浮样品 2–3 分钟。0.75 mm 厚的胶每1.0 mm 宽上样孔上样 5–10 µl 。
• 接下来的电泳和免疫印迹请参阅免疫印迹：《实验流程 1.》。
注意：根据所用的二抗，55 kDa 和 27 kDa 的一抗重链和轻链可能分别被检测到。如果使用琼脂糖偶联一抗或 ImmunoCruz™IP/WB试剂盒可使这些条带明显减低。

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