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操作细胞复苏初学者应该注意什么

发布日期：2015/7/16 9:06:21 阅读次数：5427次

细胞复苏是一简单的试验操作，但操作中有许多需要注意的事项，在实验操作中注意细小问题，才能使复苏后的细胞状态保持良好。现将细胞复苏的操作程序和注意事项总结如下。细胞复苏的原则－-快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

【注意事项】

1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。

2. 常温下二甲基亚砜（DMSO）对细胞的毒副作用较大，因此，必须在1-2 min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太低，会造成细胞的损伤，所以选择40℃复苏。

3. 贴壁细胞复苏实验标准流程是将解冻后的细胞悬液行离心，以去除冷冻保护液DMSO对细胞的损伤，但是离心也会对刚复苏的状态欠佳的细胞产生损伤。也有的实验操作是将解冻后的细胞悬液先直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。这可能使培养基中少量的DMSO对细胞造成损伤。

【操作注意】

1.可以提前把需要的体积的培养液放到培养瓶里，拧松瓶盖，放到孵箱里半小时到1小时，这样温度和ph值都已经*适合细胞生长了。

2.为防止冻存管在升温时爆裂等，可以在放入水浴前就实现在超净台里把盖子拧松一下然后再拧上。从液氮罐里拿出来不是说一定要分秒必争地放入水浴。细胞从液氮的零下1百多度升到比如负八十这个过程对细胞没有损害。有足够的时间handle这些。只不过一旦细胞化了，就应该争分夺秒地把它放入培养液了，主要是为了稀释DMSO。常温下高浓度DMSO对细胞的损害比较大。

3.水浴温度40C应该也没问题，但正规的protocol上从来都只说37C。反正应该相差不大，但不能太高了。另外，不必等细胞全化了再从水浴里取出来。只要冰块浮起来了就差不多了。我一般*多水浴不超过1.5分钟。然后经过喷酒精消毒什么的差不多又半分钟过去了。每次都还有没化的。先把已经融解的部分吸到培养瓶里，再从培养瓶里吸些培养液到冻存管里，余下的冰块瞬间就化了，再一起吸到培养瓶里。

初学者易犯错误：

1水浴锅未预热或者未预热到37℃。

2.水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。

3.离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。

4.一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。

原创作者：上海劲马实验设备有限公司

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